A biológiai minták, például csontok, növények, izmok vagy köpet előkészítése a DNS, RNS, fehérjék vagy metabolitok elemzéséhez kihívást jelenthet. A RETSCH olyan laboratóriumi malmokat és őrlőket kínál, amelyek porlasztják és homogenizálják a szilárd anyagokat, de alkalmasak sejtbontásra is. A RETSCH malmokat olyan területeken használják, mint a biotechnológia, a diagnosztika, a törvényszéki orvostan, a mezőgazdaság és a mikrobiológia.
A sejtbontás gyakran a választott módszer a sejtkomponensek baktériumokból, élesztőkből, gombákból vagy mikroalgákból történő kivonására, és vagy kémiai vagy mechanikai úton történik. A mechanikus módszerek jobban alkalmazhatók a kemény falú sejtek esetében, vagy ha a vegyszerek befolyásolhatják a kivonást, és ezért kerülni kell őket. Gyakori és hatékony módszer a gyöngyverés, amely gyöngyökkel nyírja a szuszpenzióban lévő sejteket. A gyöngyözés kis vagy nagy léptékben, különböző típusú fiolák és csövek használatával végezhető. Az egyik módszer a szuszpenzió gyöngyökkel való keverése, vortexkeverővel. Ez az eljárás azonban lassú és következetlen, különösen nagyszámú minta vagy hosszú bontási idő esetén. Jobb megoldás a RETSCH keverőmalmok használata adapterekkel, amelyek automatizálják a folyamatot, így az gyors, hatékony és reprodukálható lesz.
MM 400 malom - élesztősejt feltárása*
*A videón a korábbi modell látható, azonos működési elvvel.
Az összfehérje-koncentráció megnövelt reprodukálhatósága sejtbontás után, 7 percig
MM 400-ban, 12 perc Vortex.
Hibasávok: % standard eltérés.
A MM 400 akár 20 mintát is feldolgoz 1,5 vagy 2 ml-es Eppendorf csövekben keresztkontamináció nélkül, ami időt takarít meg a kezelő számára. Ezenkívül egy adapter is rendelkezésre áll, amely akár nyolc 50 ml-es Falcon-cső befogadására is alkalmas. A sejtbontáshoz a sejtek típusától függően változik az optimális gyöngyméret; baktériumok és élesztők esetében a 0,75-1,5 mm közötti üveggyöngyök ajánlottak, míg gombák és mikroalgák esetében a 0,1-0,5 mm közötti kisebb gyöngyök alkalmasabbak.
DNS vagy RNS extrakcióhoz a kisebb, legfeljebb 2 ml-es egyszer használatos csövek ideálisak, míg a fehérjék vagy metabolitok feldolgozásához az 50 ml-es Falcon csövekhez hasonló nagyobb üvegek jól alkalmazhatók. Az optimális göngyölési paraméterek sejttípusonként változnak. A legjobb eredmény megtalálása némi kísérletezést igényelhet. Általában 30 s (a legtöbb mikroalga) és 7 perc (élesztők általában) közötti gyöngyözés szükséges a sejtek teljes felbontásához.
Azáltal, hogy akár ötven darab 2 ml-es egyszer használatos fiolát is fogad, a Mixer Mill MM 500 vario hatékonyan növeli a sejtek felbontásához szükséges mintaátmenő képességet.
A Phaeodactylum tricornutum sejtjei a sejtbontás előtt (balra) és után (jobbra) az MM 400 és a Falcon-cső adapterrel kombinált MM 400 segítségével.
A hőmérséklet döntő szerepet játszik, különösen azokban az alkalmazásokban, ahol hőmérsékletérzékeny fehérjékről van szó, például a sejtek bontása esetén. Az egyik megoldás a kriogén őrlés (lásd a megfelelő szakaszt), a másik a sejtszuszpenzió hűtése. A MM 400 esetében kimutatták, hogy a hőnövekedés 2 ml-es csövekben még 30 Hz-en is mérsékelt; egy egyszerű megoldás a bontási idők >1 perc megszakítása az adapter és a fiolák egyperces jégfürdőben történő hűtésével. Így a hőmérséklet a használt gyöngymérettől függően 12-15 °C alatt marad.
Hőmérséklet-emelkedés a sejtbontás során az MM 400-as készülékben 30 Hz-en vagy vortexerrel, jégen hűtés a sejtbontás minden egyes perce után.
A gyöngyözés során a hőmérséklet alakulásának szabályozására a Mixer Mill MM 500 vezérlés segítségével van mód. Egy speciális adapter tizennyolc 2 ml-es egyszer használatos fiola befogadására alkalmas tételenként. A gép egy 4 °C-os hűtött vizet tartalmazó hűtőhöz van csatlakoztatva, amely viszont az injekciós üvegeket tartó adaptert hűti. Így a szuszpenzió hőmérséklete 13°C körül tartható, de a jégfürdőben történő kényelmetlen kézi megszakítási fázisok nélkül. Bár az MM 500 vezérlő nem fogadja el az egyszer használatos falcon tube adaptert, 50, 80 vagy 125 ml térfogatú rozsdamentes acél őrlőedényekkel használható (lásd a bal oldali példát: P. pastoris).
Ha a malmot folyékony nitrogénnel és a CryoPaddel együtt használjuk, és 0 °C-ra állítjuk, a 2 ml-es egyszer használatos csövekben lévő sejtszuszpenzió hőmérséklete akár 0 °C-on is tartható a szuszpenzió lefagyasztása nélkül, így a hatékony gyöngyözés továbbra is lehetséges.
Egyes biológiai anyagok, például a cisztás fibrózisos betegek köpetének vagy szövetminták, például máj, tüdő vagy daganatok, néha nehezebben homogenizálhatók teljesen. A 2 ml-es egyszer használatos csövek gyakran túl kicsik ahhoz, hogy a teljes mintatérfogat beleférjen, így a mintát a homogenizálási folyamat után fel kell osztani és újra össze kell állítani, ami plusz munkát és időt jelent a laboratóriumi rutinban.
A nagyobb, rozsdamentes acélból készült őrlőedények például képesek a teljes mintatérfogatot befogadni, de ezeket minden használat után tisztítani kell. Egy adapter a Mixer Mill MM 400 készülékhez megoldja ezt a problémát, mivel lehetővé teszi az 5 x 5 ml-es egyszer használatos csövek használatát, amelyek nagyobb kapacitással rendelkeznek és nem szükséges a tisztításuk. Tételenként egyszerre 10 minta homogenizálható. 50 ml-es sólyomcsövek is használhatók szöveti anyagok homogenizálására. Itt tételenként 8 minta dolgozható fel mindössze néhány perc alatt.
Májminta a homogenizálás előtt és után az MM 400-ban
Egyes biológiai minták, például rostos növények, kemény vénák, körmök vagy bizonyos állati vagy tumorszövetek nehezen homogenizálhatók pufferrendszerben. Vagy túl puhák, vagy túl kemények, vagy túl rostosak ahhoz, hogy szuszpenzióban hatékonyan porlaszthatók legyenek. Ezen anyagok esetében jobb alternatíva a kriogén őrlés, amely során az őrlési folyamat előtt vagy közben folyékony nitrogénnel fagyasztják le őket. Ez a technika a mintákat rideggé teszi, és könnyen homogén porrá zúzhatóvá. A kriogén őrlés előnye az is, hogy megőrzi például a fehérjék vagy az illékony vegyületek integritását, amelyek magasabb hőmérsékleten lebomolhatnak vagy elpárologhatnak. A kriogén őrlés továbbá képes megtörni egyes organizmusok, például az élesztő intracelluláris organellumait.
A ragadós anyagok, például a bogyók esetében a kriogén őrlés gyakran az egyetlen megvalósítható módszer az egyenletes minta előállítására. A táblázat néhány példát sorol fel, amelyeket sikeresen dolgoztak fel kriogén őrléssel a Mixer Mill MM 400 vagy a CryoMill berendezésben. Az MM 400-ban 2 ml-es acélcsövek használhatók kriogén őrléshez. Hasonló hatás érhető el a MM 500 control berendezésben is, nagyobb térfogatú, akár 125 ml-es őrlőedényekkel. Itt a CryoPad mus folyékony nitrogénnel dolgozni. Minden említett malomban 2 ml-es rozsdamentes acélcsövek és a megfelelő adapterek is rendelkezésre állnak a kisebb térfogatokhoz.
2 ml-es rozsdamentes acélcsövek
| Minta | Kiegésztők | Feed quantity | Őrlési idő | Sebesség | Max. végfinomság (d90)/ |
| E. coli baktériumok |
|
2 x 10 ml fagyasztott sejtpellet | 2 min | 30 Hz | teljes sejtbontás |
| izomszövet |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| fenyőtű |
|
3 min | 30 Hz | Reprodukálható RNS extrakció 20 mintából egy lépésben | |
| bogyók |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| körmök |
|
1 ujjköröm injekciós üvegenként | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| patkánybél |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Húsdarabok kriogén darálás előtt és után
Ragadós bogyók
kriogén őrlés előtt és után
Fenyőtű
kriogén őrlés előtt és után
Agaróz gél RNS elválasztáshoz porított fenyőtűből, amely jó reprodukálhatóságot és az előállított RNS mennyiségét mutatja.
A törvényszéki minták, például a haj, a csontok és a fogak többnyire törékenyek, ezért általában nincs szükség hűtésre a porítás előtt. A kívánt analitikai finomság eléréséhez előfordulhat, hogy az anyagot előzetesen egy Jaw Crusher vagy
A RETSCH a lágy, középkemény, rugalmas, szívós és szálas mintaanyagok elsődleges méretcsökkentésére szolgáló vágómalmokat kínál. A tartozékok széles választéka lehetővé teszi a különböző alkalmazásokhoz való optimális alkalmazkodást. A SM 300 három különböző rotorral és 0,25 mm-től 20 mm-ig terjedő alsó szitákkal szerelhető fel. A friss és zsíros csontokkal ellentétben a száraz csontok egy vagy két lépésben 0,25 mm alatti méretre csökkenthetők. Az SM 300 változó fordulatszámmal rendelkezik 100 és 3000 fordulat/perc között. A csontok, fogak vagy szőrzet porlasztása többnyire golyósmalmokban történik, acélból, cirkónium-oxidból vagy volfrámkarbidból készült > 5 mm-es őrlőgolyókkal.
Csontok vágómalomban történő őrlés előtt és után
Emberi haj golyósmalomban történő finomra őrlés előtt és után
Az ízületpótló műtétek, például a könyök vagy a térd műtétjének egyik lehetséges szövődménye a környező szövetek különböző baktériumok általi fertőzése. Ezek a fertőzések, amelyeket protézisízületi fertőzéseknek (PJI) neveznek, a műtét után néhány naptól akár több évig is előfordulhatnak. Nehezen kezelhetők, mivel különböző típusú baktériumok okozhatják őket, és a hagyományos módszerekkel nem mindig mutathatók ki. Ezért szükséges a baktériumokat a szövetmintákból úgy izolálni, hogy megőrizzék életképességüket, és lehetővé tegyék azonosításukat és tenyésztésüket.
Ez az a pont, ahol a Mixer Mill MM 400 egy egyszerű eljárással segíthet: A mintákat 20 ml steril demineralizált vízzel és 5 ml 1 mm-es üveggyönggyel keverjük össze egy sterilizált acéledényben. Egyszer használatos 30 ml-es széles szájú üvegek használhatók. Legfeljebb 8 palackot rázunk 3,5 percig 30 Hz-en, hogy a baktériumokat eltávolítsuk a mintákból anélkül, hogy elpusztítanánk őket. A baktériumok ezután könnyen tenyészthetők agarlemezen a további elemzéshez. Ez a módszer magas kimutatási aránnyal rendelkezik (A.-L. Roux et. al 2010), és bármilyen szilárd fertőzött szövetre alkalmazható, még akkor is, ha az beültetett anyagot tartalmaz.
A RETSCH termékek és szolgáltatások leányvállalatok és teljes körűen képzett forgalmazók globális hálózatán keresztül érhetők el. Munkatársaink szívesen segítenek Önnek bármilyen kérdésben.
A gyöngyözés, a sejtbontásra széles körben alkalmazott mechanikai módszer, alapvető fontosságú a sejtkomponensek kivonásához olyan mikroorganizmusokból, mint a baktériumok, élesztőgombák, gombák vagy mikroalgák. Ez a folyamat gyöngyökkel nyírja a szuszpenzióban lévő sejteket, és különböző méretű üvegek és csövek segítségével különböző léptékben végezhető. Az adapterekkel ellátott RETSCH keverőmalmok által biztosított automatizálás egyszerűsíti a gyöngyözés folyamatát, biztosítva annak gyors, hatékony és reprodukálható voltát.
A gyöngyök optimális mérete és paraméterei sejttípusfüggőek, így a legjobb eredmények eléréséhez kísérletezésre van szükség. Az MM 400 például akár 20 mintát is képes feldolgozni 1,5 vagy 2 ml-es Eppendorf-csövekben keresztkontamináció nélkül. A rendelkezésre álló adapter akár nyolc 50 ml-es Falcon-cső befogadását is lehetővé teszi, ami tovább növeli a folyamat sokoldalúságát.
A kriogén őrlés nélkülözhetetlenné válik, ha olyan kihívást jelentő mintákat kezelünk, amelyek ellenállnak a homogenizálásnak a hagyományos pufferrendszerekben. Ez különösen igaz a rostos növényekre, a kemény vénákra, a körmökre vagy a különleges állati vagy tumorszövetekre. A technika folyékony nitrogén alkalmazásával fagyasztja le a mintákat az őrlési folyamat előtt vagy közben. Ez a kriogén fagyasztás törékennyé teszi a mintákat, megkönnyítve azok homogén porrá zúzását.
A kriogén őrlés folyamata határozott előnyökkel jár, megőrizve a fehérjék vagy az illékony vegyületek integritását, amelyek magasabb hőmérsékleten lebomlanának vagy elpárologhatnának. Emellett bizonyos organizmusoknál hatékonynak bizonyul az intracelluláris organellumok lebontásában. Különösen a kriogén őrlés az egyetlen megvalósítható módszer a ragadós anyagok, például a bogyók egységes mintáinak előállítására.
Az optimális eredmények érdekében a kriogén őrlés olyan speciális berendezésekkel végezhető, mint a CryoMill vagy a 2 ml-es acélcsövek befogadására alkalmas MM 400 kegolyósmalom. A kifejezetten folyékony nitrogénnel (LN2) való munkához tervezett MM 500 vezérlésű Mixer Mill MM 500 kifejezetten nagyobb, akár 125 ml-es őrlőedényeket fogad be.
Az olyan törvényszéki minták, mint a csontok vagy fogak porítására az állkapocsdarálók vagy a vágómalmok az optimális választás a méretcsökkentési folyamat első lépéséhez. A RETSCH a különböző mintaanyagok, köztük puha, közepesen kemény, rugalmas, kemény és szálas anyagok elsődleges méretcsökkentésére tervezett vágómalmok változatos választékát kínálja. A tartozékok széles választéka biztosítja, hogy ezek a malmok zökkenőmentesen a különböző alkalmazásokhoz igazíthatók.
A sokoldalú SM 300 például három különböző rotorral és 0,25 mm-től 20 mm-ig terjedő alsó szitával, valamint 100 és 3000 fordulat/perc között változtatható fordulatszámmal rendelkezik. Ez a rugalmasság teszi kiváló eszközzé a speciális törvényszéki mintafeldolgozási igényekhez való alkalmazkodáshoz.
A további feldolgozási lépésekhez fontolja meg az 5 mm-nél nagyobb őrlőgolyókkal felszerelt golyósmalmok használatát, amelyek olyan anyagokból készültek, mint az acél, a cirkónium-oxid vagy a volfrámkarbid. A hajszálak porlasztásához az olyan keverőmalmok, mint az MM 400 a legjobb választás.
